15.34. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN TOÀN PHẦN TRONG VẮC XIN VÀ SINH  PHẨM

 

Protein có trong vắc xin và sinh phẩm được xác định theo nhiều phương pháp khác nhau, tùy theo từng loại vắc xin  và sinh phẩm.

 

1. Phương pháp Lowry

Nguyên lý

Protein có trong mẫu vắc xin thử  bị tủa với acid tricloracetic nóng. Xác định lượng tủa để tính ra lượng protein có trong vắc xin, sinh phẩm.

Phương pháp tiến hành

Pha loãng mẫu thử (nếu cần thiết) để chỉnh hàm lượng protein của mẫu thử trong khoảng 20 - 120 µg/ml.

Thêm 1 ml dung dịch acid tricloracetic 10% vào một ống nghiệm có chứa 1 ml mẫu thử. Đun nóng ở 80^OC trong nồi cách thủy trong 15 phút. Làm nguội ở nhiệt độ phòng.

Ly tâm ở tốc độ 3.500 vòng/phút trong 30 phút, loại bỏ nước nổi.

Thêm vào phần lắng cặn 2 ml dung dịch acid tricloracetic 5%. Lắc kỹ trên máy lắc và ly tâm lại một lần nữa ở tốc độ 3.500 vòng/phút trong 30 phút, loại bỏ nước nổi..

Thêm 2,5 ml dung dịch Alkalin vào mỗi ống nghiệm nêu trên và ủ ở nhiệt độ phòng (thời gian ủ tùy từng loại mẫu thử) để hòa tan phần lắng cặn.

Thêm 2,5 ml nước cất và 0,5 ml thuốc thử Forlin (pha loãng 1/2), ủ ở 37 ^OC trong 30 phút. Ly tâm với tốc độ 3.500 - 6.000 vòng/phút trong 30 phút (với các chế phẩm chứa chất hấp phụ nhôm). Đo mật độ quang học ở bước sóng 750 nm trên quang phổ kế.

Song song tiến hành thử nghiệm với mẫu trắng: thay vào 1 ml mẫu thử là 1 ml nước cất.

Dựng đường chuẩn: Dựng đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn (dung dịch albumin chuẩn ở các nồng độ 25 µg/ml; 50 µg/ml; 100 µg/ml; 150 µg/ml). Dựa vào hàm lượng protein tìm được trên đường chuẩn tính ra hàm lượng protein có trong mẫu thử.

Cách pha dung dịch Alkalin: (pha ngay trước khi dùng)

- Dung dịch đồng sulfat pentahydra 2%t: hòa tan 2 g đồng sulfat pentahydrat vào vừa đủ 100 ml nước cất.

- Dung dịch natri tartrat 4%: hòa tan 4 g natri tartrat vào vừa đủ 100 ml nước cất.

- Trộn lẫn 2 dung dịch trên được dung dịch A.

- Hòa 0,8 g natri hydroxyd và 4 g natri carbonat vào vừa đủ 100 ml nước cất  được dung dịch B.

- Trộn 50 ml dung dịch B và 1 ml dung dịch A được dung dịch Alkalin.

 

2. Đo độ hấp thụ thực của protein ở bước sóng 280 nm

Nguyên lý

Protein trong dung dịch hấp thụ tia tử ngoại ở bước sóng 280 nm, do sự có mặt các amino acid dãy thơm, chủ yếu là tyrosine và tryptophan trong cấu trúc protein.

Phương pháp tiến hành

Chuẩn bị mẫu thử: Pha loãng mẫu thử đến hàm lượng protein trong khoảng 0,2 mg/ml đến 2 mg/ml, bằng dung dịch đệm thích hợp.

Chuẩn bị mẫu chuẩn: Pha loãng mẫu chuẩn bằng cùng dung dịch đệm với mẫu thử và có hàm lượng protein tương ứng với mẫu thử.

Giữ dung dịch mẫu thử và mẫu chuẩn ở nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thụ các dung dịch này bằng cóng thạch anh ở bước sóng 280 nm, dùng nước cất làm mẫu trắng.

Hàm lượng protein trong mẫu thử (C_U) được tính bởi công thức:

                                    C_U = C_S (A_U/A_S)

Trong đó:         C_S : Hàm lượng protein trong dung dịch chuẩn.

                        A_U: Độ hấp thụ của mẫu thử.

                        A_S: Độ hấp thử của dung dịch chuẩn.                  

 

3. Phương pháp Bradford

Nguyên lý

Dựa trên sự kết hợp giữa thuốc nhuộm Coomasie với protein trong môi trường acid.

Phương pháp tiến hành

Pha loãng mẫu thử bằng nước cất đến hàm lượng thích hợp trong khoảng đường chuẩn.

Chuẩn bị dung dịch chuẩn BSA (bovin serum albumin) có hàm lượng trong khoảng 0,1mg/ml đến 1mg/ml.

Dùng nước cất làm mẫu trắng.

Thêm 2,5 ml thuốc nhuộm Coomasie 20% vào 0,05 ml mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử, lắc đều. Để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng. Đo mật độ quang (Phụ lục 4.1) ở  bước sóng 595 nm (không dùng cóng thạch anh do sẽ bị thuốc nhuộm gắn vào)

Hàm lượng protein trong mẫu thử được tính toán dựa vào đường chuẩn.

 

4. Phương pháp đồng/bicinchoninic acid.

Nguyên lý

Dựa vào sự khử của ion Cu²⁺ thành Cu¹⁺ do protein, dùng acid bicinchoninic (BCA) để xác định Cu¹⁺.

Phương pháp tiến hành

Pha loãng mẫu thử bằng nước cất đến hàm lượng thích hợp trong khoảng đường chuẩn.                                      

Pha dung dịch chuẩn bằng nước cất (không ít hơn 5 nồng độ) có hàm lượng trong khoảng 10 mg/ml đến 1200 mg/ml.  

Dùng nước cất làm mẫu trắng.

Thêm 2 ml thuốc thử đồng-BCA vào 0,1ml mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử, lắc đều. Ủ trong nồi cách thuỷ 37 ^OC trong 30 phút. Làm nguội ở nhiệt độ phòng 60 phút, đo mật độ quang (Phụ lục 4.1) ở  bước sóng 562 nm, dùng cóng thạch anh.

Dựa vào đường chuẩn tính ra hàm lượng protein có trong mẫu thử.                            

Pha thuốc thử BCA: Hòa tan 10 g dinatri bicinchoninat, 20 g natri carbonat monohydrat, 1,6 g natri tatrat, 4 g natri hydroxide và 9,5g natri hydrogen carbonate vào nước cất. Điều chỉnh pH 11,25 nếu  cần bằng dung dịch natri hydroyd hoặc dung dịch natri  hydrogen carbonate. Thêm nước cất vừa đủ 1000 ml, lắc đều.

Pha thuốc thử đồng-BCA: Trộn 1ml dung dịch đồng sulfat 40 g/l với 50 ml thuốc thử BCA.

 

5. Phương pháp biuret.                        

Nguyên lý

Dựa vào sự tương tác của ion Cu²⁺ với protein trong dung dịch alkalin, sản phẩm thu được có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 545 nm.

Phương pháp tiến hành

Pha loãng mẫu thử bằng dung dịch nước muối sinh lý đến hàm lượng thích hợp trong khoảng đường chuẩn.

Pha dung dịch chuẩn bằng dung dịch nước muối sinh lý (không ít hơn 3 nồng độ) có hàm lượng trong khoảng từ 0,5 mg/ml đến 10 mg/ml.

Dùng dung dịch nước muối sinh lý làm mẫu trắng.

Lấy một thể tích dung dịch mẫu thử, thêm đồng lượng dung dịch natri hydroxyid 60 g/l, lắc đều. Ngay lập tức cho thuốc thử biuret với lượng bằng 0,4 lần thể tích dung dịch mẫu thử và lắc nhanh. Để yên ở nhiệt độ phòng 15 phút. Trong vòng 90 phút sau khi cho thuốc thử biuret, đo mật độ quang (Phụ lục 4.1) của mẫu thử ở bước sóng 545 nm.

Song song tiến hành với mẫu trắng và mẫu chuẩn.

Dựa vào đường chuẩn tính ra hàm lượng protein có trong mẫu thử.

Pha thuốc thử biuret: Hòa tan 3,46 g đồng sulfat(TT) trong 10 ml nước cất nóng, để nguội (dung dịch A). Hòa tan 34,6 g natri citrat và 20 g natri carbonat khan vào 80 ml nước cất nóng, để nguội (dung dịch B). Trộn dung dịch A và B, thêm nước cất vừa đủ 200 ml. Dùng trong 6 tháng, không dùng nếu thấy vẩn đục hoặc có tủa.

 

6. Phương pháp quang phổ huỳnh quang.

Nguyên lý

Dựa vào dẫn xuất của protein với o-phthalaldehyd do chất này phản ứng với các amin chính của protein (N-terminal amino acid và nhóm e-amino của lysin tồn dư).

Phương pháp tiến hành

Pha loãng mẫu thử bằng dung dịch nước muối sinh lý đến hàm lượng thích hợp trong khoảng đường chuẩn. Điều chỉnh pH từ 8 đến 10,5 trước khi thêm thuốc thử phthaldehyd.                                         

Pha dung dịch chuẩn bằng dung dịch nước muối sinh lý (không ít hơn 5 nồng độ) có hàm lượng trong khoảng từ 10 mg/ml đến 200 mg/ml. Điều chỉnh pH pH từ 8 đến 10,5 trước khi thêm thuốc thử phthaldehyd.                   

Dùng dung dịch nước muối sinh lý làm mẫu trắng.

Trộn 10 ml các dung dịch mẫu thử, mẫu chuẩn, mẫu trắng với 0,1ml thuốc thử phthaldehyde, để yên ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Thêm 3ml dung dịch natri hydroxyd 0,5M và lắc đều. Đo cường độ huỳnh quang các dung dịch mẫu chuẩn và mẫu thử ở bước sóng kích thích 340 nm và bước sóng phát xạ  giữa 440 và 445 nm.

Dựa vào đường chuẩn tính ra hàm lượng protein có trong mẫu thử.

Pha dung dịch đệm borate: Hòa tan 61,83g acid boric  trong nước cất và điều chỉnh pH  10,4 bằng dung dịch kali hydroxyd, thêm nước cất vừa đủ 1000ml, lắc đều.

Pha dung dịch gốc phthaldehyd: Hòa tan 1,20 g phthalaldehyde trong 1,5ml methanolm (TT), thêm 100 ml dung dịch đệm borate, lắc đều. Thêm 0,6 ml dung dịch macrogol 23 lauryl ether và lắc đều. Bảo quản ở nhiệt độ phòng sử dung trong 3 tuần.

Pha thuốc thử phthaldehyd: Thêm 15 ml 2-mercaptoethanol vào 5ml dung dịch gốc phthaldehyd. Chuẩn bị dung dung dịch này trước khi dùng 30 phút. Sử dụng trong vòng 24 giờ.

 

Tiêu chuẩn chấp thuận

Mỗi loại vacxin, sinh phẩm có tiêu chuẩn khác nhau về hàm lượng protein toàn phần (dựa vào tiêu chuẩn của WHO hoặc tiêu chuẩn Việt Nam cho vắc xin hay sinh phẩm đó).